中央紅軍主力長征后，他任瑞（金）會（昌）縣游擊司令部參謀長，在長汀、瑞金、會昌交界的武夷山區(qū)堅持了極其艱苦的3年游擊戰(zhàn)爭。1937年春任汀瑞游擊支隊參謀長，繼續(xù)在閩贛邊堅持游擊戰(zhàn)爭。

1937年抗戰(zhàn)爆發(fā)后，周桂生奉命奔赴皖南抗日前線。到達安徽太平以后，新四軍4個支隊勝利會師。他從1938年起任新四軍第2支隊副團長、團長，皖南第2縱隊司令員。在抗日前線，他身先士卒，經(jīng)歷了無數(shù)次戰(zhàn)斗，多次率部痛擊日偽軍。

1940年12月底，新四軍老三團、新三團奉命合編為新四軍第二支隊，周桂生任司令員。1941年1月，國民黨頑固派制造皖南事變，新四軍皖南部隊遭到包圍，新四軍決定，除軍直機關(guān)部隊外，編成3個縱隊，周桂生任第二縱隊司令員，率第二縱隊為中央縱隊，掩護軍直屬隊及教導(dǎo)總隊突圍。

為了保護軍首長的安全，周桂生親臨前沿陣地指揮作戰(zhàn)。13日黃昏，率部轉(zhuǎn)移至獅形山西北高地時，遭遇敵人重兵圍攻。激戰(zhàn)中，周桂生身上多處中彈，仍端槍沖向敵人，掩護戰(zhàn)友突圍，最終壯烈犧牲，時年35歲。